Aislamiento y caracterización de cepas de la bacteria entomopatógena Bacillus thuringiensis a partir de plantaciones de café infestadas con broca (Hypothenemus hampei Ferrari)

Hernández-Soto, Alejandro

2002

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Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular de la Universidad de Costa Rica Grupo Ingeniería Genética de Cultivos

Proyecto de Graduación (Bachillerato en Ingeniería en Biotecnología). Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Biología, 2002.

El café es de gran importancia económica y social para Costa Rica. La principal plaga para este cultivo es la broca (Hypothenemus hampei). Las medidas de control que existen para esta plaga son ineficientes, costosas y de difícil implementación. La bacteria entomopatógena Bacillus thuringiensis (Bt) representa una nueva estrategia de control sostenible, ya que sintetiza proteínas insecticidas específicas. Esta bacteria se puede utilizar para la producción de bioinsecticidas inocuos para otros seres vivos, o bien para conferir resistencia a plagas mediante la expresión de las proteínas Cry o δ-endotoxinas en el genoma de plantas mejoradas por ingeniería genética. Esta estrategia plantea la necesidad de obtener una colección amplia de cepas Bt. El objetivo de esta investigación fue el establecimiento de una bacterioteca de Bt, aislada a partir de agroecositemas donde H. hampei era abundante. Para ello se colectaron 417 muestras ambientales en 5 fincas ubicadas en el Valle Central y una fuera del mismo, 110 muestras correspondieron a: suelo, hojarasca, follaje y frutos infestados y 317 a insectos muertos. De las 417 muestras procesadas, se logró aislar 250 cepas con morfología de colonia similar a Bt, y de ellas, un total de 162 mostraron cristales. Se presentó una gran diversidad de cristales por cepa y entre las diferentes cepas. Las morfologías más frecuentes fueron la redondeada, irregular y romboidal. En el análisis electroforético de las proteínas Cry, 65 de las 162 cepa, mostraron patrones proteicos prominentes de diversos pesos moleculares entre los 20 y 145 KDa y se seleccionaron para su análisis por PCR de diferentes genes cry1, cry3-cry 7, cry 8, cry11, cry 5-cry12-cry14, cyt, vip1, vip2 y vip3 (colección base). De las restantes 97 que mostraron patrones tenues, se seleccionaron 40 cepas con δ-endotoxinas de pesos moleculares que oscilaran entre los 50-80KDa y se analizaron con los iniciadores cry3-cry7 (colección complementaria). De la colección base, un 97% amplificaron con los iniciadores para vip3, seguido de cry1con 47%, cry 3-cry 7 con 20% , cry 8 y vip2 con 6% y vip1 con 3% . Algunas cepas presentaron combinaciones entre estos genes, detectándose 16 perfiles genéticos diferentes para la subfamilia de genes cry1 (cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ad, cry1B, cry1C, cry1D y cry1E) . Un total de 27 de las 40 cepas de la colección complementaria, amplificaron con los iniciadores cry3-cry7. En total, se dispone de 38 cepas con genes cry3-cry7, dos cepas con genes cry3-cry7 y cry8, dos cepas con los genes cry8 y cuatro cepas con los genes cry1B con potencial para combatir coleópteros.

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